恒溫培養(yǎng)箱應用于大腸桿菌細胞的制備實驗

電熱恒溫培養(yǎng)箱采用電熱膜加熱方式，在箱體與內膽之間安裝電熱膜，使用熱傳遞方式加熱，加熱速度快。多應用于實驗室的各種細胞菌類的培養(yǎng)，今天要說的是大腸桿菌，下面喆圖小編講一些操作流程供大家參考一下。
細胞經(jīng)過一些特殊方法（電擊法、cacl2法）等處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源dna分子進入的細胞，即感受態(tài)細胞（compenentcells）。
實驗方法原理：
帶有外源dna的重組質粒，在體外構建后，導入宿主細胞，隨著細胞的大量復制、繁殖，才能夠**會獲得純的重組質粒dna，該過程稱之為轉化過程。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如：cacl2，rucl等化學試劑）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許外源dna的載體分子通過。
實驗材料：
e.colidh5α菌株
試劑、試劑盒：lb固體培養(yǎng)基、lb液體培養(yǎng)基、cacl2、鎂、sob、tfb、儀器、耗材：培養(yǎng)皿、恒溫搖床、聚丙烯管、電熱恒溫培養(yǎng)箱、臺式高速離心機、無菌工作臺、燒瓶、恒溫水浴鍋、低溫冰箱、制冰機、分光光度計、微量移液、錐形瓶、試管
實驗步驟：
1、從37℃培養(yǎng)16-20h的平板中挑取一個單菌落(直徑2-3mm)，轉到一個含有100mllb或sob培養(yǎng)基的1l燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3h。一般經(jīng)驗，1od600約含有大腸桿菌dh5α109個/ml。
2、將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，培養(yǎng)物冷卻至0℃。
3、于4℃用sorvallgs3特頭（或與之相當?shù)霓D頭）以4100r/min離心10min，以回收細胞。
4、倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使后的痕量培養(yǎng)液流盡。
5、每50ml初始培養(yǎng)液用30ml預冷的0.1mol/lcacl2-mgcl2溶液(80mmol/lmgcl2，20mmol/lcacl2)重懸每份細胞沉淀。
6、于4℃用sorvallgs3轉頭（或與之相當?shù)霓D頭）以4100r/min離心10min，以回收細胞。
7、倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使后的痕量培養(yǎng)液流盡。
8、每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預冷的0.1mol/lcacl2(或tfb)重懸每份細胞沉淀。
9、此時，可以用新鮮制備的感受態(tài)細胞直接做轉化實驗，也可以將細胞凍存于-70℃。
注意事項：
1.為達到轉化，活細胞數(shù)務必少于108個細胞/ml，對于大多散大腸桿菌來說，這相當于od值為0.4左右。為保證細菌培養(yǎng)物的生長密度不致過高，可每隔15-20min測定od600值來監(jiān)測，用監(jiān)測的時間及od值列一個圖表，以便預測培養(yǎng)物的od600值到0.4的時間，當od600值達到0.35時，收獲細菌培養(yǎng)物。
2.在菌株與菌株之間，od值與每毫升中活細胞散間的關系變化很大，因此有必要通過漶量特定腦桿菌的生長培養(yǎng)物在生長周期的不同時相的od600值，并將各稀釋維度的培養(yǎng)物鋪于無的lb瓊脂板以計算每一時相的活細胞散，從而使分光光度計讀數(shù)得到標準化。
3.對大多數(shù)大腸桿菌（mc106除外），采用tfb代替cacl2可得到相同或較好的結果。dagert和ehrlieh的實驗(1979)曾表明，細胞可以于4℃在cacl2溶液中保存24-48h，在貯存的初12-24h內，轉化率增加4-6倍，然后降低到初始水平。
4.的新鮮程度，一定要選新鮮平板的單，即剛涂布生長過夜的平板。
5.菌體的od600值，jm109或bl21，od值為0.35，dh5α為0.4，要盡量保證od值不要過高，較不能**過0.6。
6.低溫處理的時間，做完后冰上保存12-24h后分裝，并保存于-80℃。
7.試劑和用品，所有的用品（離心管、藥瓶等）用新的，如果使用舊的，要確保干凈，cacl2溶液。
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